Métodos de investigación molecular y biológica y su uso

Métodos de investigación biológicos molecularesjuega un gran papel en la medicina moderna, criminalística y biología. Gracias a los avances en el campo de los estudios de ADN y ARN, una persona puede estudiar el genoma del organismo, identificar el agente causal de la enfermedad, reconocer el ácido nucleico deseado en una mezcla de ácidos, etc.

Métodos de investigación biológicos moleculares. ¿Qué es?

Ya en la década de 1970 y 1980, los científicosdescifrar el genoma humano Este evento impulsó el desarrollo de la ingeniería genética y la biología molecular. El estudio de las propiedades del ADN y el ARN ha llevado al hecho de que ahora es posible utilizar estos ácidos nucleicos para diagnosticar la enfermedad y estudiar genes.

Preparación de ADN y ARN

Métodos biológicos moleculares de diagnósticorequieren la presencia de material de partida: con mayor frecuencia son ácidos nucleicos. Hay varias formas de aislar estas sustancias de las células de los organismos vivos. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas, y esto debe tenerse en cuenta al elegir el método de aislamiento de ácidos nucleicos en forma pura.

1. Preparación de ADN según Marmur. El método consiste en tratar la mezcla de sustancias con alcohol, como resultado de lo cual precipita el ADN puro. La desventaja de este método es el uso de sustancias agresivas: fenol y cloroformo.

2. Aislamiento de ADN por Boom. La sustancia básica utilizada aquí es guanidina tiocianato (GuSCN). Promueve la deposición de ácido desoxirribonucleico en sustratos especializados, de los que posteriormente se puede recolectar con un tampón especial. Sin embargo, GuSCN es un inhibidor de PTC, e incluso una pequeña parte de él, atrapada en el ADN precipitado, puede afectar el curso de la reacción en cadena de la polimerasa, que desempeña un papel importante en el trabajo con ácidos nucleicos.

3. Precipitación de impurezas. El método difiere de los anteriores en que no se precipitan las moléculas del ácido desoxirribonucleico, sino las impurezas. Para hacer esto, usa intercambiadores de iones. La desventaja es que no todas las sustancias pueden precipitar.

4. Detección masiva. Este método se usa en aquellos casos en que no se necesita información precisa sobre la composición de la molécula de ADN, pero es necesario obtener algunos datos estadísticos. Esto se debe al hecho de que la estructura del ácido nucleico puede dañarse mediante el tratamiento con detergentes, en particular, con álcalis.

Clasificación de los métodos de investigación

Todos los métodos de investigación de biología molecular se dividen en tres grandes grupos:

1. Amplificación (usando una variedad de enzimas). Esto incluye PCR - reacción en cadena de la polimerasa, que desempeña un papel importante en muchos de los métodos de diagnóstico.

2. Sin denominación. Este grupo de métodos está directamente relacionado con la operación de mezclas de ácidos nucleicos. Los ejemplos son 3 tipos de transferencia, hibridación in situ, etc.

3. Métodos basados ​​en el reconocimiento de una señal de una molécula sonda que se une a una sonda específica de ADN o ARN. Un ejemplo es un sistema de hibridación en una solución de sistema híbrido de captura (hc2).

Enzimas que pueden usarse en métodos de biología molecular

Muchos métodos de diagnóstico molecular implican el uso de una amplia gama de enzimas. A continuación se muestran los más utilizados:

1. Restrictase - "corta" la molécula de ADN en las partes necesarias.

2. ADN polimerasa: sintetiza una molécula bicatenaria de ácido desoxirribonucleico.

3. Transcriptasa inversa (revertase): utilizada para sintetizar ADN en la matriz de ARN.

4. ADN ligasa - responsable de la formación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos.

5. Exonucleasa: elimina los nucleótidos de las secciones terminales de la molécula de ácido desoxirribonucleico.

La PCR es la principal forma de amplificar el ADN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) está activase utiliza en la biología molecular moderna. Este es un método en el que se puede obtener una gran cantidad de copias de una sola molécula de ADN (amplificar moléculas).

Las funciones principales de PCR son:

- diagnóstico de enfermedades;

clonación de ADN y genes.

Para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasarequiere los siguientes elementos: molécula de ADN inicial, un ADN polimerasa termoestable (Taq o Pfu), fosfatos de desoxirribonucleótidos (fuentes de bases de nitrógeno), los cebadores (cebador 2 1 molécula de ADN) y el propio sistema de tampón, lo que puede llevar a cabo todas las reacciones.

La PCR consta de tres etapas: desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación.

1. Desnaturalización. A una temperatura de 94-95 grados Celsius, se produce la ruptura de los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN, y como resultado obtenemos dos moléculas de cadena simple.

2. Recocido de los primers. A una temperatura de 50-60 grados Celsius, los cebadores se unen a los extremos de las moléculas de ácido nucleico monocatenario por el tipo de complementariedad.

3. Elongación. A una temperatura de 72 grados, se produce la síntesis de moléculas hija de doble cadena de ácido desoxirribonucleico.

Secuenciación de ADN

Métodos de investigación biológicos molecularesa menudo requieren el conocimiento de la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido desoxirribonucleico. La secuenciación se usa para determinar el código genético. El diagnóstico molecular del futuro se basará en el conocimiento obtenido al determinar la secuencia de una persona.

Se distinguen los siguientes tipos de secuencia:

• secuenciación por Maxam-Gilbert;
• secuenciación por Sanger;
• pirosecuenciación;
• secuenciación nanoporosa.